El Emperador Carlos V, antes y después de su matrimonio con Isabel de Portugal, mantuvo varias relaciones amorosas con distintas mujeres que le dieron otros tantos hijos ilegítimos. De todos ellos, solamente dos tuvieron un papel relevante en la vida política y dinástica de los reinos de su padre, Juan y Margarita. El caso de Margarita fue poco menos que curioso pues fue la única hija a la que no relegó a un convento o a una vida alejada de la corte. Educada por otra Margarita de Austria, regente de los Países Bajos, su existencia transcurrió entre su tierra natal e Italia, fue duquesa de Florencia y de Parma y gobernadora de los Países Bajos.
Margarita de Parma nació el 28 de diciembre de 1522 en Oudenarde, Bélgica, fruto de una relación amorosa entre el emperador Carlos V y una dama flamenca llamada Juana van der Gheist. La pequeá fue primero educada por una familia noble pero pronto su tía – abuela, llamada como ella y entonces gobernadora de los Países Bajos, se hizo cargo de su educación hasta su fallecimiento en 1530, un hecho que afectó sinceramente a la muchacha. El emperador nombró a su hermana María de Austria sucesora de Margarita en el gobierno de aquellos territorios. María había quedado viuda del rey húngaro y dedicó el resto de su vida a servir a los intereses de la dinastía.
El 9 de julio de 1529 Carlos V legitimaba a su hija por expreso deseo de su tía Margarita, quien entonces aún gobernaba en los Países Bajos y tenía a la niña bajo su tutela. Empezó entonces a formar parte de las estrategias dinásticas y matrimoniales de un imperio en constantes conflictos y alianzas territoriales.
Después del sacco de Roma, acaecido en 1527 cuando los ejércitos de Carlos entraron por la fuerza en la Ciudad Eterna, el emperador y el papa Clemente VII firmaron la paz poniendo como condición un enlace matrimonial entre el hijo natural del pontífice, Alejandro de Médici, y la pequeña Margarita.
En 1531 Alejandro se hacía con el control de Florencia como duque con el beneplácito del emperador y en 1536, se casaba con Margarita en Nápoles, cuando era una joven de trece años. Aquel primer matrimonio no se llegó a consumar pues Margarita se quedó viuda un año después cuando Alejandro fue asesinado por un miembro de los Médici perteneciente a una rama secundaria de esta poderosa familia. No debió llorar demasiado a un marido que desde el primer momento no escondió sus relaciones amorosas extramatrimoniales con su amantes Tadea Malaspina.
Después de pasar una breve temporada en los Países Bajos al lado de la gobernadora María de Austria, su padre volvió a utilizarla para sus negocios dinásticos. Esta vez Margarita se tuvo que casar con Octavio Farnesio, duque de Parma, enlace acontecido en 1536. Convertida en duquesa de Parma, Margarita tuvo al que sería su único hijo, Alejandro Farnesio, quien asumiría un importante protagonismo en el gobierno de su hermanastro Felipe II y junto a otro hermano bastardo, Juan de Austria.
Cuatro años después de la abdicación del Emperador Carlos V de la corona imperial en 1555, dejando el Imperio a su hermano Fernando y el resto de territorios a su hijo Felipe, éste decidió nombrar a su hermanastra Margarita gobernadora de los Países Bajos. En un primer momento, la duquesa se enorgulleció de poder seguir los pasos de las anteriores gobernadoras, Margarita y María, a las que siempre había tenido en gran estima y realizaron un papel impecable al servicio del emperador.
Pero cuando fue ella la que tuvo que tomar las riendas de aquellos territorios, la situación se había convertido en un auténtico polvorín con los conflictos entre católicos y protestantes y los deseos de autogobierno de las autoridades que no aceptaban con buen grado el papel del nuevo monarca. A pesar de que Margarita intentó gestionar la situación como pudo, la llegada del Duque de Alba con sus métodos drásticos y la implantación de la Inquisición por orden de Felipe hicieron la situación poco menos que insostenible.
En 1567, después de años intentando utilizar la diplomacia y esperando respuestas de su hermanastro que nunca llegaban, Margarita presentó su dimisión ante Felipe II quien aceptó destituirla en favor del Duque de Alba. Margarita volvió entonces a Italia. Tras un intento de recolocar a su hermanastra en los Países Bajos, esta vez junto a su hijo Alejandro Farnesio, sistema de poder que nunca funcionó, la duquesa de Parma regresó definitivamente a Italia donde permaneció hasta su muerte, el 18 de enero de 1586.